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凝膠層析分離的一般原理和操作方法

凝膠層析分離的一般原理和操作方法

一、目的要求:

1. 學(xué)習(xí)與掌握親和層析和凝膠層析分離的一般原理和操作方法。

2. 了解自動(dòng)化純化設(shè)備基本組成和原理。

3. 了解親和吸附層析瓊脂糖、凝膠過(guò)濾葡聚糖的基本性質(zhì)。掌握組氨酸標(biāo)簽蛋白的基本性質(zhì)和純化原理和操作;掌握緩沖液置換和脫鹽的原理和操作。

 

二、實(shí)驗(yàn)概述(如右圖)

實(shí)驗(yàn)步驟:

1. 樣品預(yù)處理:即通過(guò)超聲這種細(xì)胞破碎的手段,將在大腸桿菌E.coli中表達(dá)的重組的帶6個(gè)His標(biāo)簽的綠色熒光蛋白釋放到相應(yīng)的緩沖液當(dāng)中,再通過(guò)離心,0.2微米濾膜過(guò)濾等去除細(xì)胞碎片和別的污染物;

2. 組氨酸標(biāo)簽蛋白親和層析:HisTrapTMHP crude, 1mL預(yù)裝層析柱,進(jìn)行親和層析,一步就可以達(dá)到90%左右的純度

3. 凝膠過(guò)濾層析脫鹽去除咪唑:HiTrapTM  Desalting 5mL預(yù)裝層析柱進(jìn)行脫鹽,置換緩沖液

4. 電泳:對(duì)純化過(guò)的樣品的檢測(cè)。

三、設(shè)備以及試劑準(zhǔn)備(試劑均使用化學(xué)純以上):

1. 儀器:核酸蛋白檢測(cè)儀HD系列、自動(dòng)部分收集器BSZ\DBS系列、恒流泵HL系列

2. 樣品:EGFP原液

3. 層析柱:HisTrap HP 1ml, 1根;HiTrap Desalting 5ml,1根

4. 層析緩沖液

名稱(chēng)

配方

體積

緩沖液A

親和結(jié)合緩沖液

脫鹽平衡和洗脫緩沖液

25mM 磷酸鹽緩沖液,150mM NaCl, 20mM 咪唑,pH7.4

250ml

緩沖液B

親和洗脫緩沖液

25mM 磷酸鹽緩沖液,150mM NaCl, 500mM 咪唑,pH7.4

100ml

去離子水

脫氣或負(fù)壓脫氣

500ml

層析柱保存緩沖液

20%乙醇


 

5. 注射器,燒杯,負(fù)壓脫氣瓶等實(shí)驗(yàn)室常用容器

 

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1. 儀器和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:

所有緩沖液需要過(guò)0.2um膜過(guò)濾,負(fù)壓脫氣抽濾瓶脫氣,脫氣裝置如圖所示

樣品預(yù)處理:即通過(guò)超聲這種細(xì)胞破碎的手段,將在大腸桿菌E.coli中表達(dá)的重組的帶6個(gè)His標(biāo)簽的綠色熒光蛋白釋放到相應(yīng)的緩沖液當(dāng)中,再通過(guò)離心,0.45 微米濾膜過(guò)濾等去除細(xì)胞碎片和別的污染物;用注射器吸取大于2ml樣品

將注射器內(nèi)的樣品從樣品環(huán)3號(hào)口推入,注意不要將氣泡推入樣品環(huán)(如右圖)。


TEL:13798128437

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